1.试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M的柠檬酸钠缓冲液：58.82g柠檬酸三钠及7.56g柠檬酸溶于200ml纯水，调pH至 6.0，纯水1:100稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水，调pH至 7.4洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB显色试剂盒：Cat. KT1002a抗体稀释液：3%BSA-PBS0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0～95.5%乙醇苏木素：苏木精2g溶于250ml无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠 0.2g和冰醋酸20ml 2.实验步骤1组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min或者65℃过夜；2脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10分钟；3水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4洗涤：自来水冲洗1次，PBS浸泡3min；5抗原修复：放入稀释100倍的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6洗涤：纯水浸泡2次，PBS浸泡1次，每次3min；7灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8洗涤：纯水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；9封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10洗涤：纯水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；11一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。12洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；13加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗（KT1002a Reagent B），37℃湿盒孵育10min；14洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；15加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP（KT1002a Reagent C）, 37℃湿盒孵育10min；16洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；17显色：滴加适量DAB显色液(KT1003a)至切片上，室温显色1~5min，自来水冲洗；18复染：苏木素染色5min，蒸馏水冲洗5min；19分化： 0.5%盐酸乙醇混合液中分化，自来水冲洗3-4次， PBS中浸泡10-20秒返蓝，自来水冲洗2次。20脱水：经过70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇浸泡，每次5min；21透明：二甲苯浸泡2次，每次10-15min；22封片：晾干后加中性树胶，盖玻片封片；23结果：显微镜观察，记录结果。

1.试剂和溶液1）转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 204）封闭液：TBST配制的5%牛奶5）抗体稀释液：TBST配制的5%牛奶6）显色系统：ECL显色 2.实验步骤1电泳：将裂解液进行SDS-PAGE电泳，80v，30分钟，120v，90分钟；2转膜：PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF膜上，10v，150分钟；3染色：氨基黑染色5分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4膜活化：将PVDF膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2次后再用TBST洗涤3次；5封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA中，室温混摇2h；6一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3×5min；8二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3×5min；10ECL显色：将膜取出放入混匀的ECL显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min显影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；12结果分析：用扫描仪将曝光后的X光胶片扫描，做后续结果分析。